膜蛋白抽提试剂盒
产品名称:膜蛋白抽提试剂盒

产品货号:KGP350
规格包装:50T
品牌产地:南京凯基
产品价格:580元

产品名称
规格
货号
品牌
价格
膜蛋白抽提试剂盒
50T
KGP350
南京凯基
580
100T
KGP3100
南京凯基
980
NE-PER(R)  Eukaryotic Membrane Protein Extraction
Kit
89826
Pierce
2666

 
凯基膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
Cat Number      For Research Use Only
Store at -20℃ for one year
Expire date                                                                    

一、   试剂盒说明
 本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白。其原理是裂解细胞后,先离心分离出质膜粗提物,再利用特殊的抽提Buffer,选择性地分离提取膜蛋白,抽提Buffer一种特殊的去污剂,在4℃时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer,但在37时,抽提Buffer分为水相和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中,根椐该性质分离出膜蛋白产物不仅含细胞膜蛋白,也含胞器质膜蛋白。提取方法简单,可靠,快速。获得的膜蛋白纯度高,可用于PAGE电泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后续研究。
二、   试剂盒组份
组份
KGP350(50 tests)
KGP3100(100 tests)
储存温度
Lysis Buffer
50 mL
25 mL× 4
4
抽提Buffer
50 mL
25 mL× 4
4
蛋白酶抑制剂
50μL
100μL
-20
溶解Buffer
15 mL
30 mL
4
TCA试剂
5 mL
10 mL
-20
Loading Buffer
1 mL
2 mL
-20
DTT(1M)
50μL
100μL
-20
三、      操作步骤
Ⅰ 实体组织蛋白的提取
1组织样本(200300mg)尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎;
2组织样本中加入1mL Lysis Buffer(注:使用前,每mL Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂和1μL 1M DTT,置玻璃均浆器冰上均质3050次(或超声破碎细胞,每次30 S34次,每次间隔1 min),置于冰上冷却均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不小于90%;
3将均浆液转移至冷的离心管中,于4, 3000 rpm 离心10 min,弃沉淀;
4取上清转移至新冷离心管中,于4, 14 000 rpm 离心30 min,所得上清转至新管中,即为胞浆蛋白,分装冷冻保存;
5取步骤4离心所得沉淀,加入1mL冷的抽提Buffer涡旋振荡混匀后,4放置10 15min
【注:因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4混匀后加入
6 4℃, 3000rpm 离心5min,取上清转移至新管(注意勿将沉淀带入上清),进行下步提取;
7置于37水浴10min
8室温,13 000rpm离心5min,样品分成上层和下层(含膜蛋白);
【注:建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到。或室温静置30分钟~1小时亦可见分层。以下亦同。
 
如需更高纯度脂溶性膜蛋白,可选做步骤9-14
9取下层,加入500μL冰冷灭菌水,4放置5min
10、置于37水浴10min
11、室温,13 000rpm离心5min,样品分成上层和下层(含膜蛋白);
12、取下层,加入500μL冰冷灭菌水,4放置5min
13、置于37水浴10min
14、室温,13 000rpm离心5min,样品分成上层和下层(含膜蛋白);
15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量(因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值),分装冷冻保存。
 
Ⅱ 培养细胞蛋白提取
1收集不少于1×107细胞,用冷PBS pH7.4)洗涤细胞两次(每次3000 rpm离心5 min);
2在细胞样本中加入1mL Lysis Buffer(注:使用前,每mL Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂和1μL 1M DTT),置玻璃均浆器冰中均质3050次(或超声破碎细胞,每次30 S34次,每次间隔1 min),置于冰上冷却均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不小于90%;
3将均浆液转移至冷的离心管中,于4, 3000 rpm 离心10 min,弃沉淀;
4取上清转移至新冷离心管中,于4, 14 000 rpm 离心30 min,所得上清转至新管中,即为胞浆蛋白,分装冷冻保存;
5取沉淀,加入1mL冷的抽提Buffer涡旋振荡混匀后,4放置10 15min
【注:因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4混匀后加入
6 4℃, 3000rpm 离心5min,取上清转移至新管(注意勿将沉淀带入上清),进行下步提取;
7置于37水浴10min
8室温,13 000rpm离心5min,样品分成上层和下层(含膜蛋白);
【注:建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到。或室温静置30分钟~1小时亦可见分层。以下亦同。
如需更高纯度脂溶性膜蛋白,可选做步骤9-14
 
9取下层,加入500μL冰冷灭菌水,4放置5min
10、置于37水浴10min
11、室温,13 000rpm离心5min,样品分成上层和下层(含膜蛋白);
12、取下层,加入500μL冰冷灭菌水,4放置5min
13、置于37水浴10min
14、室温,13 000rpm离心5min,样品分成上层和下层(含膜蛋白);
15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量(因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值),分装冷冻保存。
 
SDS  PAGE 电泳操作步骤
1进行PAGE电泳前,取该提取物,每100μL膜蛋白提取物,加入约300μL的溶解Buffer 和约100μL三氯乙酸 (TCA)试剂,混匀后置冰上20~30 min后, 13 000rpm,离心15 min,尽可能除去上清;
2沉淀加入1mL丙酮,室温静置10min后,13 000rpm离心15 min
3弃上清,沉淀真空旋干或置冰上干燥约10 min(敞开离心管盖),加入适当体积的Loading Buffer(使用前每100μL Loading Buffer加入2~5μL巯基乙醇)溶解,彻底分散(枪头反复吹吸或剧烈涡旋),煮沸5min;【注:加入Loading Buffer后如有部分难溶物,可取上清继续上样;如加入Loading Buffer后溴酚蓝转呈黄色,此为少量TCA残留所致,不影响电泳结果。请参照Marker标准。
4上样进行SDS PAGE电泳
 
四、 注意事项:
 1、所有的试剂及器具均需预冷后使用。细胞或组织量需达到要求。
 2抽提Buffer 4时,为混悬状态,请于此温度下混匀后吸取加入粗提物中。
3、 室温25℃~37℃时,抽提Buffer需静置30分钟以上可看到分上下两层,其中约9/10至4/5为上层水相,下层只占1/10至1/5为有机相。
4、 因产品采用不透明的包装瓶,因此无法观察到上述分层现象,可将该BUFFER倒入玻璃烧杯或试管中静置30分钟~1小时可见分层。