TSA多标，报价里为什么要多收2张片的费用？

TSA 基于酪胺信号放大技术，灵敏度极高，因此微弱的非特异性信号也会被同步放大，背景亦如此，很容易出现假阳性，所以相比普通荧光，它更依赖对照。

一个行之有效的TSA多重荧光免疫组化实验，需要解决三个问题

而这些问题，仅仅依靠样本本身是无法回答的，因此需要设置对照体系，对整个实验体系进行逐步验证。

阳性对照是指选用文献公认明确表达该靶蛋白的组织切片，整套染色流程和待测样本同步操作，核心目的是验证整个实验操作/体系是否正常有效，用来排除实验 “完全失败”。

主要是证明一抗有效、二抗有效、TSA 酪胺、H₂O₂、过氧化氢酶体系工作正常； 排除试剂失效、孵育时间不足、抗原修复失败、脱蜡 / 通透出问题，具体而言：

抗体是否有效

如果阳性对照样本没有出现预期的特异性荧光，那么需要考虑一抗的有效性

抗体本身存在问题，即便样本有表达也是无济于事的。

抗原修复是否成功

制作石蜡切片组织首先要经过固定，那么抗原表位可能被甲醛交联遮盖，因此都需要进行抗原修复使其表位重新暴露。如果修复条件不到位，抗原暴露不足，抗体无法充分结合抗原导致弱信号甚至完全没有信号，因此阳性对照在这里可以帮助我们判断

TSA放大体系是否正常

除了各个环节的操作细节，TSA试剂本身也对实验结果有着重要的影响

后续的脱色与重复染色，任何一个环节异常，都可能导致信号缺失，因此阳性对照没有信号，排除抗体原因后需要检查整个TSA体系以及实验流程。

如果阳对没有信号，不管待测样本有无荧光，全部作废，体系存在故障。这就是阳性对照验证的核心内容。

相比阳性对照，阴性对照更为重要，阴性对照解决开篇提到的第二个问题：正片染出来的荧光是不是目的蛋白产生的，是真还是假？

因此，阴性对照的核心目的就是排除一切非特异性发光，包括

排除抗体非特异性结合

实验中，以抗以及二抗都可能发生非特异性结合，如：

不加一抗，仅加二抗及TSA试剂，如果依然出现荧光，说明发光来自于二抗或者TSA体系，绝非目的蛋白，这就是明显的假阳性。

排除组织自发光

许多组织自身就有较强的自发荧光，如：

这些组织自发光这TSA的信号放大作用下更加明显，形成较强的背景荧光，所以阴性对照抗原帮助我们区分哪些是背景，哪些是真正的目标信号。

排除TSA体系发光

除了各个环节的操作细节，TSA试剂本身也对实验结果有着重要的影响

染色–HRP催化–抗体洗脱–重复下一轮染色，这这个过程中，如果上一轮HRP没有完全灭活，也可能继续催化下一轮TSA反应导致假阳性号。

阴对发亮 = 背景污染，实验结果不可信，不能说明靶蛋白阳性。阴性片几乎无荧光，则证明信号是目标靶蛋白发出。

基于以上内容，建议设置以下几类对照

通过设立对照，让实验结果可信可靠，数据完整闭环，审稿无需质疑。